DMD基因突变是假肥大型肌营养不良症的分子病理基础,其中大片段缺失约占所有突变类型的65%。依据阅读框学说,通常DMD基因移码突变导致Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD),而整码突变导致Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BMD)。DMD基因缺失的机制甚为复杂,但在DMD基因发生断裂缺失后大都通过非同源末端连接进行修复。DMD基因缺失连接片段即为DMD基因断端重接形成的一段变异的DNA序列。 对连接片段进行克隆和序列特点分析,可以为研究DMD基因缺失重组机制提供帮助;同时采用PCR技术扩增这段变异的DNA序列可以考虑用于缺失型DMD/BMD携带者检测和产前诊断。我们进行的研究工作分为三个部分:一、DMD基因缺失和5例中国人连接片段序列分析;二、利用连接片段进行缺失型DMD/BMD携带者检测;三、连接片段在缺失型DMD/BMD产前诊断的应用和评价。 一、DMD基因缺失和5例中国人连接片段序列分析 1.研究目的 通过阅读框规则分析所选缺失型DMD/BMD患者基因型与表型的关系;通过进行DMD基因缺失连接片段测序,分析中国人连接片段序列的一些特点并探讨DMD基因缺失和修复的机制。 2.方法 研究对象:6例经证实的缺失型DMD/BMD患者。其中病例1、病例2、病例3、病例4为DMD,病例5、病例6为BMD,来自同一家系,故实际互相无血缘关系的研究对象为5例。抽提制备以上患者外周血基因组DNA。 DMD基因缺失突变的阅读框检测:通过外显子PCR检测确定病例1为DMD基因第46～50外显子缺失,病例2为第51～55外显子缺失,病例3为第31～43外显子缺失,病例4为第45～54外显子缺失,相同家系的病例5、病例6为第3～5外显子缺失。采用在线程序对以上6例研究对象进行外显子缺失的阅读框检测,判断其缺失突变所致可读框改变类型。 连接片段的克隆和测序:在研究对象DMD基因缺失断裂点所在的相应内含子上每间隔一定距离(一般为3 kb)设计1对引物,通过PCR步移的方法定位相应内含子上的断裂点位点。对5例研究对象内含子上断裂点位点成功定位后,分别在靠近其上下游断裂点处各设计1对配对引物,以直接对各例连接片段进行长片段PCR扩增,将扩增成功的PCR产物纯化后测序。 连接片段的序列特点分析:对所测5例中国人连接片段5'端和3'端断裂点两侧的序列进行重复序列、基质附着区(matrix attachment regions,MARs)、回文序列、TTTAAA序列以及基因缺失后修复方式的分析。 3.结果 6例病例基因型和表型的关系:经检测病例1、病例2、病例3、病例4的缺失突变均属框外缺失(out-of-frame deletion),为改变遗传信息可读框的移码突变,其相应的临床表型均为DMD。同一家系的病例5、病例6的缺失突变属框内缺失(in-frame deletion),为缺失下游仍然保持正常可读框的整码突变,其相应的临床表型为BMD。 5例中国人连接片段的序列特点:分析发现JUNCTION 1的5'端断裂点位于第45内含子LINE/L1序列内,邻近MAR,附近存在回文序列,其3'端断裂点邻近第50内含子的MAR;JUNCTION 2的5'端断裂点附近存在回文序列,其3'端断裂点位于第55内含子LINE/L1序列内;JUNCTION 3的5'端断裂点位于第30内含子LINE/L1序列内,附近存在回文序列;JUNCTION 4的5'端断裂点位于第44内含子LINE/L1序列内,邻近MAR,其3'端断裂点两旁存在回文序列;JUNCTION 5的5'端断裂点位于第2内含子SINE/Alu序列内,其3'端断裂点邻近第5内含子的MAR,附近有TTTAAA序列。 5例DMD基因缺失相连接的序列均无广泛同源性。发现JUNCTION 1具有5 bp的微小同源序列连接断裂点两端;JUNCTION 2为平端连接,另外在其5'端断裂点上游39 bp位置发现一处A→G点突变;JUNCTION 3插入7 bp序列连接断裂点两端;JUNCTION 4具有4 bp的微小同源序列连接断裂点两端;JUNCTION 5插入26 bp序列并在连接点周围形成3个13 bp的重复连接断裂点两端,且在其5'端断裂点上游20 bp位置发现一处A→G点突变。 4.结论 6例假肥大型肌营养不良症病例基因型和表型的关系均符合阅读框规则,其中4例为out-of-frame缺失突变导致DMD,2例为in-frame缺失突变导致BMD。 DMD基因的一些二级结构特点促进其断裂重组。5例中国人连接片段序列总体上具备容易导致DMD基因缺失重组的所有分子结构特点,包括重复序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。
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